LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERI

BAB I

PENDAHULUAN

      A.  Latar Belakang

Pseudomonas sp. merupakan suatu bakteri terdiri dari sejumlah kuman batang negatif Gram yang tidak meragi karbohidrat, hidup aerob di tanah dan air. Habitat alam tersebar luas dan memegang peranan penting dalam pembusukan zat organik. Bergerak dengan flagel polar, satu atau lebih. Beberapa diantaranya adalah fakultatif khemolitotrof, dapat memakai H₂ atau CO sebagai sumber karbon. Katalase positif.  Ada yang patogen bagi binatang atau tanaman dan ada yang patogen bagi kedua-duanya. Kebanyakan spesies Pseudomonas tidak menyebabkan infeksi pada manusia, tetapi kuman ini penting karena bersifat oportunis patogen, dapat menyebabkan infeksi pada individu dengan ketahanan tubuh yang menurun. Bakeri dapat menghasilkan enzim yang berguna bagi tubuh. Salah satunya yaitu enzim amilase dari bakteri Pseudomonas sp. (Deshwal, 2013: 53).

Penggunaan enzim amilase pemecah pati akan menurunkan tingkat konsumsi energi dalam proses hidrolisis sehingga akan menurunkan biaya produksi. Enzim ini yang paling banyak dikembangkan yaitu enzim yang berasal dari mikroba. Seperi dari bakteri Pseudomonas sp. Beberapa keunggulan dari enzim amilase adalah waktu produksi cepat, proses mudah dimodifikasi dan tidak memerlukan tempat yang luas (Nangin, 2015: 1033). Berdasarkan uraian di atas, maka dilakukanlah percobaan ini.

B.  Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam percobaan ini yaitu:

1.      Bagaimana cara membuat dan mensterilkan media?

2.      Bagaimana cara melakukan peremajaan bakteri?

3.      Bagaimana cara isolasi enzim selulase dari bakteri termofilik?

4.      Bagaimana aktivitas enzim selulase?

C.  Tujuan

Tujuan dalam percobaan ini yaitu:

1.    Untuk mengetahui cara membuat dan mensterilkan media.

2.    Untuk mengetahui cara melakukan peremajaan bakteri.

3.    Untuk mengetahui cara isolasi enzim selulase dari bakteri termofilik.

4.    Untuk mengukur besar aktivitas enzim selulase.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Bakteri Pseudomonas sp.

Bakteri umunya uniseluler/sel tunggal, tidak mempunyai klorofil, berkembangbiak dengan pembelahan sel secara inversal atau biner. Hidup bebas secara kosmopolitan, khususnya di udara, di tanah, di dalam air, pada bahan makanan, pada tubuh manusia, hewan maupun tumbuhan. Adapula yang bersimbiosis dengan jasad hidup lain baik hewan maupun tanaman (Suriawiria, 2008: 8).

Genus Pseudomonas adalah Gram-negatif batang aerobik motil yang tersebar luas di seluruh alam dan ditandai dengan fleksibilitas metabolisme yang tinggi, adanya sistem enzim yang rumit seperti klasifikasi fluorescent pseudomonad dan membuat populasi dominan di tanah seperti Agrobacterium, Arthrobacter, Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter, Chromobacterium, Erwinia, Flavobacterium, Micrococcous, Pseudomonas dan Serratia. Strain Pseudomonas menghasilkan berfluoresensi di bawah sinar UV dikenal sebagai Pseudomonas fluorescent. Bakteri ini bermanfaat untuk menghasilkan warna alami. Strain ini ditandai dengan uji biokimia.  Klasifikasi Pseudomonas aerugenosa (P. Alcaligenes, P. Borbori, P. Straminea) yang bermanfaat sebagai bakteri gram negatif namun merupakan bakteri yang sangat berbahaya dan klasifikasi Pseudomonas clrhoraphis (P. fragi, P. Aurantiaca) (Deshwal, 2013: 53).

B. Media Bakteri

     Berdasarkan fungsi  atau sifatnya beberapa macam medium, antara lain medium umum, medium selektif dan medium diferensial. Berdasarkan komposisi kimianya, dikenal medium alami, medium semi sintetik, dan medium sintetik (Yanti, 2011: 1).

Medium untuk pertumbuhan bakteri diharapkan merupakan medium yang memungkinkan isolat dapat tumbuh dengan baik dan memberikan penampakan genetik yang maksimum. Menurut Hidayat (2006: 24), bahwa media yang memberikan produk yang baik adalah:

1.    Kisaran medium dengan nutrien pembatas berbeda (misalnya C, N, P dan O).

2.    Untuk tiap tipe nutrien digunakan bentuk-bentuk yang berbeda yang mampu mendukung pertumbuhan.

3.    Gunakan polimer atau bentuk kompleks pada nutrien pembatas pertumbuhan.

4.    Hindarkan bentuk-bentuk yang mudah diasimilasi, seperti karbon (glukosa) atau nitrogen (NH4⁺) yang dapat menyebabkan penekanan katabolisme.

5.    Pastikan kofaktor yang diketahui ada (Co³⁺, Mg²⁺, Mn²⁺ dan Fe²⁺).

6.    Gunakan buffer yang dapat meminimalkan perubahan media yang terjadi.

C. Sterilisasi

Perlu sterilisasi terhadap medium dan alat-alat yang akan digunakan untuk kegiatan pembiakan bakteri. Sterilisasi adalah suatu program untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Pemilihan cara sterilisasi didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Cara sterilisasi yang umum digunakan secara rutin ialah dengan pemanasan. Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembab, bila tanpa kelembaban disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering (Yanti, 2011: 1).

Proses sterilisasi alat bedah umumnya dilakukan berdasarkan pemanasan basah yaitu autoklafisasi dan pemanasan kering melalui oven. Pemantauan proses sterilisasi didasarkan dengan tiga cara yaitu secara fisika dengan mengukur temperatur, tekanan dan waktu (Meliawaty, 2012: 147).

  Secara kimia dengan autoclave tape, sterilization pouch yang memperlihatkan perubahan warna bila telah tercapai siklus sterilisasi yang dilakukan; secara biologis dengan menggunakan spore strip atau suspensi biakan spora; untuk cara autoklafisasi digunakan Geobacillus stearothermophilus, sedangkan pada sterilisasi dengan oven dipakai Bacillus atrophaeus (Meliawaty, 2012: 148).

D. Tahapan Pembiakan Mikroba

Menurut Hidayat (2006: 25-26), bahwa pembiakan bakteri dapat dilakukan dengan cara membiakannya pada media sebagai berikut:

1.    Kultur cair diperkaya

Kultur diperkaya yaitu tehnik yang berhasil meningkatkan jumlah mikroba yang diinginkan sehingga menjadi lebih banyak daripada mikroba lain dalam inokulum asli. Proses yang terjadi menghasilkan populasi campuran dan memberikan kondisi yang cocok untuk mikroba.

    2.  Penggunaan medium padat

Medium padat dapat digunkan untuk memperoleh penghasil enzim tertentu. Teknik ini biasanya meliputi penggunaan medium selektif yang berhuungan dengan substrat untuk pertumbuhan yang mendukung tipe penghasil enzim.

Menurut Hidayat (2006: 4) bahwa mikroba yang baik memiliki beberapa syarat yaitu sebagai berikut:

1.    Murni, proses-proses tertentu harus menggunakan biakan murni (dari suatu strain tertentu) yang telah diketahui sifat-sifatnya. Untuk menjaga agar tetap murni dalam proses maka kondisi lingkungan harus dijaga tetap steril. Penggunaan inokulum terdiri dari biakan yang murni.

2.    Unggul, mikroba harus menghasilkan perubahan-perubahan yang dikehendaki secara cepat dan dengan hasil yang besar. Sifat unggul yang ada harus dapat dipertahankan.

3.    Stabil, mikroba harus memiliki sifat-sifat yang tetap, tidak mengalami perubahan karena mutasi atau lingkungan.

Enzim merupakan rantai asam amino yang melipat. Tiap-tiap urutan asam amino menghasilkan struktur pelipatan dan sifat-sifat kimiawi yang khas. Rantai protein tunggal kadang-kadang dapat berkumpul bersama dan membentuk kompleks protein. Kebanyakan enzim dapat mengalami denaturasi (yakni terbuka dari lipatannya dan menjadi tidak aktif) oleh pemanasan atau denaturasi kimiawi. Denaturasi ini tergantung pada jenis-jenis enzim dan dapat bersifat reversibel maupun ireversibel (Baharuddin, 2011: 64).

Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi dalam sel maupun di luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 10⁸ sampai 10¹¹ kali lebih cepat daripada apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Sehingga enzim dapat berfungsi sebagai katalis yang sangat efisien dan mempunyai derajat kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia (Poedjiadi, 2012: 143).

Enzim selulase dapat diproduksi dari mikroba selulotik baik kapang maupun bakteri, kapang selulotik yang biasa digunakan dari jenis Trichoderma, Aspergillus, dan Penicillium. Sedangkan bakteri yang bisa menghasilkan selulase adalah Pseudomonas, Cellulomonas, Bacillus, Micrococcus, Cellovibrio, dan Sporosphytophaga. Diantara semua jenis kapang selulotik, Trichoderma reesei adalah kapang yang paling banyak diteliti karena mampu mensekresikan selulase sekitar 80% (Wahyuningtyas, 2013: 22).

E. Laminar Air Flow

Laminar Air Flow adalah meja kerja steril untuk melakukan kegiatan inokulasi/ penanaman. Laminar Air Flow merupakan suatu alat yang digunakan dalam pekerjaan persiapan bahan tanaman, penanaman dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke botol yang lain dalam kultur in vitro. Alat ini diberi nama Laminar Air Flow Cabinet, karena meniupkan udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari, debu dan spora-spora yang mungkin jatuh ke dalam media, waktu pelaksanaan penanaman (Oktaviani, 2014: 1).

BAB III

METODE PERCOBAAN

A.    Waktu dan Tempat

Hari/Tanggal       : Senin 8 Juni 2014

Pukul                   : 13.00 WITA - Selesai

  Tempat                : Laboratorium Biokimia Fakultas Sains dan Teknologi  

                                 UIN Alauddin Makassar

B.     Alat dan Bahan

1.   Alat

Alat-alat yang digunakan yaitu Laminar Air Flow Cabinet, oven, shaker water bath Thermo Scientific MAXQ 7000, autoclave, inkubator, neraca analitik, hotplate, pipet skala 10 mL, erlenmeyer 250 mL, gelas kimia 250 mL, cawan petri, bunsen, jarum ose dan tabung reaksi.

2.      Bahan

Bahan-bahan yang digunakan yaitu alkohol (ROH) 70%, aluminium foil, aquades (H₂O), bacto agar, carboxymethyl cellulose (CMC) sabun, kalium hidrogen fosfat (KH₂PO₄), kalsium klorida (CaCl₂), kalium nitrat (KNO₃), magnesium sulfat anhidrat (MgSO₄.7H₂O), pati, spiritus, tissue dan yeast excstrak.

 

C.    Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada percobaan ini adalah sebagai berikut:

1.    Sterilisasi

Membungkus cawan petri dan tabung reaksi menggunakan kertas buram. Kemudian memasukkan kedalam oven pada suhu 180^oC selama 1 jam.

2.    Pembuatan Media Selulotik

Menimbang bacto agar 1,25 g, menambahkan CMC 1 g, CaCl₂ 0,002 g, KH₂PO₄ 0,05 g, KNO₃ 0,075 g, MgSO₄ 0,02 dan yeast ekstrak 0,2 g. Melarutkan dalam 100 mL aquades. Menghomogenkan hingga bercampur sempurna. Memasukkan kedalam erlenmeyer. Mensterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121^oC selama 30 menit. Menyimpan dalam laminar air flaw. Melewatkan tabung reaksi dan mulut erlenmeyer pada pembakar spiritus. Menuangkan kedalam tabung reaksi. Menyimpan tabung reaksi dalam keadaan miring. Menuangkan pada cawan petri. Mendiamkan beberapa saat hingga media memadat. Mencelupkan ose dalam alkohol lalu memijarkan. Meremajakan pada media selulotik dengan jalur zig-zag. Menginkubator selama 24 jam pada suhu 37^oC.

3.    Pembuatan Media Inokulum

Menimbang CMC 1 g, menambahkan CaCl₂ 0,002 g, KH₂PO₄ 0,05 g, KNO₃ 0,075 g, MgSO₄ 0,02 g dan yeast ekstrak 0,2 g. Melarutkan dalam 100 mL aquades. Menghomogenkan hingga bercampur sempurna. Memasukkan kedalam erlenmeyer. Mensterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121^oC selama 30 menit. Memindahkan bakteri dari media selulotik. Memasukkan dalam shaker selama 1x24 jam.

4.    Pembuatan Media Produksi

Menimbang CMC 2,5000 g, menambahkan CaCl₂ 0,0101 g, KH₂PO₄ 0,2504 g, KNO₃ 0,3750 g, MgSO₄ 0,1214 g dan yeast ekstrak 1,0011 g. Melarutkan dalam 250 mL aquades. Menghomogenkan hingga bercampur sempurna. Memasukkan kedalam erlenmeyer. Mensterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121^oC selama 30 menit. Memindahkan bakteri dari media inokulum. Memasukkan dalam shaker selama 2x24 jam. Setiap 1x12 jam, bakteri dipindahkan dalam botol UC.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.  Hasil Pengamatan

Tabel 4.1 Hasil Peremajaan

No.	Media	Perlakuan	Hasil
1.	Kultur	-	-
2.	Selulotik	·         - Membuat media dengan menimbang dan mencampurkan Bakto agar 1,25 g + CMC 1 g + CaCl2 0,002 g + KH2PO4 0,05 g + KNO3 0,075 g + MgSO4 0,02 g + yeast ekstrak 0,2 g dan melarutkan dalam 100 mL akuades ·         - Mensterilisasi media ·         - Menuang ke dalam cawan petri ·         Mendinginkan ·         - Melakukan peremajaan bakteri ·         Menginkubasi	Bakteri tidak ada yang tumbuh
3.	Inokulum	·         - Membuat media dengan menimbang dan  mencampurkan CMC 1 g + CaCl2 0,002 g                  + KH2PO4 0,05 g + KNO3 0,075 g + MgSO4 0,02 g + yeast ekstrak 0,2 g dan melarutkan ke dalam 100 mL akuades. ·         - Mensterilisasi media ·         - Menshaker 1 x 24 jam ·         10	Keruh (ada bakteri yang tumbuh)
4.	Produksi	·         Membuat media dengan menimbang dan mencampurkan CMC 2,5000 g + CaCl2 0,0101 g + KH2PO4 0,2504 g + KNO3 0,3750 g + MgSO4 0,1214 g + yeast ekstrak 1,0011 g dan melarutkan ke dalam 250 mL akuades. ·         -Mensterilisasi media ·         -Menshaker 4 x 12 jam ·         Setiap 1 x 12 jam dipipet 10 mL ke dalam botol UC	Keruh (Ada bakteri yang tumbuh)

B. Pembahasan

Peremajaan biakan dan kultur pada bakteri Pseudomonas sp. dilakukan dengan memindahkan atau memperbarui biakan bakteri dari biakan lama ke medium tumbuh yang baru secara berkala. Teknik peremajaan biakan merupakan cara paling tradisional yang digunakan untuk memelihara koleksi isolat mikroba. Peremajaan biakan ini juga bertujuan untuk menyelamatkan isolat dari kontaminasi oleh bakteri lain dan memberikan penyegaran pada nutrien yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri.

Peremajaan kultur bakteri dilakukan dengan menggunakan peralatan yang steril. Sterilisasi  alat yang tahan panas dilakukan dalam oven untuk menghilangkan bakteri-bakteri yang menempel dalam alat. Prinsip kerja alat ini yaitu sterilisasi melalui mekanisme konduksi panas. Sedangkan alat-alat yang tidak tahan panas diautoclave untuk menghilangkan bakteri-bakteri yang menempel dalam alat yang akan digunakan. Prinsip kerja Autoklaf yaitu mensterilkan dengan memaparkan uap jenuh pada tekanan tertentu selama waktu dan suhu terentu pada objek, sehingga terjadi pelepasan energi dan uap yang mengakibatkan kematian mikroorganisme secara irreversible akibat denaturasi atau koagulasi protein dari mikroorganisme dan bekerja hingga suhu 121⁰C. Media yang digunakan juga perlu disterilisasi, hal ini bertujuan untuk mensterilkan media sehingga tidak ada bakteri lain yang tumbuh dalam media yang akan mengganggu pertumbuhan bakteri yang diinginkan. Medium yang digunakan yaitu medium segar dengan jenis yang sama seperti medium awal bertujuan untuk mempercepat fase adaptasi dan mempersiapkan sel pada fase eksponensial.

Bakteri yang berada dalam fase eskponensial atau tahap propagasi ini mensintesis enzim dan mengatur aktivitasnya sehingga mampu tumbuh lebih efisien dalam kondisi baru. Peremajaan juga memberikan nutrisi baru bagi bakteri sehingga sel-selnya dapat tumbuh sehat. Medium selulotik berisi bacto agar yang merupakan medium umum digunakan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni, CMC bertujuan sebagai agar plate, CaCl₂ berfungsi untuk menumbuhkan sel secara kompeten, KH₂PO₄ berfungsi sebagai larutan penyangga sehingga media yang akan digunakan tidak terlalu pekat, KNO₃ digunakan sebagai sumber nitrogen yang baik untuk bakteri, MgSO₄ berfungsi sebagai sumber sulfur dan magnesium yang baik untuk bakteri dan yeast ekstrak berfungsi sebagai bahan pertumbuhan khusus untuk bakteri dan akan menggumpalkan campuran media yang lainnya.

Medium selulotik didinginkan bertujuan untuk mencegah terbunuhnya bakteri saat proses peremajaan apabila menggunakan media yang panas. Penuangan media dalam cawan petri bertujuan sebagai tempat tumbuhnya bakteri. Penggoresan dilakukan dalam laminar airflow karena alat ini merupakan alat khusus yang digunakan  dalam pekerjaan persiapan bahan tanaman, penanaman dan pemindahan tanaman yang menggunakan aliran udara yang ditarik dari ruangan menggunakan filter. Hal ini dilakukan dengan menggunakan api agar tidak ada bakteri asing yang ikut dalam alat ataupun media. Bakteri yang telah digores pada media dimasukkan dalam incubator bertujuan untuk mengadaptasikan bakteri pada medianya. Prinsip kerja alat ini yaitu mengubah energi listrik menjadi energi panas. Kawat nikelin akan menghambat aliran elektron yang mengalir sehingga mengakibatkan peningkatan suhu kawat. Media selulotik ini dapat digunakan pada beberapa bakteri Pseudomonas sp untuk menghasilkan selulosa yang maksimal. Media selulotik ini tidak diperoleh bakteri. Hal ini disebabkan karena cara penggoresan yang kurang baik.

Pembuatan media inokulum berfungsi untuk menghasilkan bakteri Pseudomonas sp dari biakan awalnya. Pembuatan media ini menggunakan cara sterilisasi yang sama dengan sterilisasi alat dan media selulotik. Bahan yang digunakan untuk media ini juga sama, hanya yang membedakannya yaitu pada media inokulum tidak digunakan bacto agar. Hasil sterilisasi ini dimasukkan dalam shaker water bath agar media yang tersebut merata kandungan bahan-bahannya. Prinsip kerja alat ini yaitu pada saat saklar digeser pada posisi on, maka arus listrik dari sumber akan memberi suplly listrik pada heater. Heater yang diberi arus listrik akan memberikan panas pada alat, suhu semakin tinggi. Sensor thermostat yang ditempatkan di daerah pemanasan pada waterbath akan ikut menjadi panas dan memuaikan cairan dalam sensor tersebut. hasil yang diperoleh yaitu larutan keruh yang menandakan ada bakteri yang tumbuh.

            Media inokulum yang sudah jadi dipindahkan ke media produksi yang telah dibuat seperti cara yang dilakukan pada media inokulum. Media produksi ini bertujuan untuk melihat apakah bakteri mampu mengeluarkan enzim selulase. Bakteri yang telah ditumbuhkan didekantasi menggunakan sentifuge yang prinsip kerjanya yaitu dimana objek diputar secara horizontal pada jarak radial dari titik dimana dititik tersebut dikenakan gaya. Filtrat yang diperoleh keruh menandakan adanya bakteri. Filtrat yang diperoleh dari hasil ini diuji lanjut untuk mengetahui aktivitas bakteri yang mampu melepaskan enzim selulase. Pertumbuhan bakteri Pseudomonas sp melalui Pembelahan biner yaitu pembelahan sel yang dimulai dari prmbelahan inti menjadi 2 dan di ikuti oleh pembelahan sitoplasma, Pseudomonas sp. dapat hidup pada kisaran suhu 45-65^oC dengan pH maksimum 5,6. Bakteri ini dapat hidup di luar sel (ekstaseluler) seperti pada jaringan ikat dan rongga-rongga jaringan. Bakteri Pseudomonas sp. dalam botol ini akan diukur kadar enzim yang dihasilkan yang dilanjutkan menggunakan metode spektrofotometer UV-VIS.

  

BAB V

PENUTUP

A.  Kesimpulan

Kesimpulan dari percobaan ini yaitu:

1.    Mensterilkan media dapat dilakukan dengan cara pemanasan langsung menggunakan oven pada suhu 180 ^oC.

2.    Proses peremajaan bakteri dapat dilakukan dengan pembuatan media, yaitu media kultur, selektif, inokulum dan produksi.

3.    Isolasi enzim sululase dapat dilakukan dengan bakteri termofil yaitu bekteri Pseudomonas sp.

4.    Aktivits enzim selulase menandakan bahwa bakteri Pseudomonas sp. termasuk bakteri ekstraseluler.

B. Saran

Saran untuk percobaan selanjutnya yaitu sebaiknya menggunakan mikroba berupa jamur penghasil enzim selulase yang lebih baik seperti Thricoderma sp.

DAFTAR PUSTAKA

Baharuddin, Maswati. Biokimia Dasar. Makassar: Alauddin Press, 2011.

Hidayat, Nur, dkk. Mikrobiologi Industri. Yogyakarta: CV Andi Offeset, 2006.

Meliawaty, Florence. “Efisiensi Sterilisasi Alat Bedah Mulut melalui Inovasi Oven dengan Ozon dan Infrared” Jurnal JKM 11 No. 2 (2012), http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad= rja&uact= 8&ved =0CBw  &url=http%3A%2F%2Fjbkt.ub.ac.id (14 Juni 2015), h. 147-164.

Oktaviani, Dyah Ayu. “Instruksi Kerja Pemakaian dan Pemeliharaan Laminar Air Flow” (2014), http://mikrovet.pkh.ub.ac.id/wp-content/uploads/2014/11/ 01300- 06220-IK- LAF.pdf (14 Juni 2015), h. 1-3.

Poedjiadi, Anna. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press, 2012.

Suriawiria, Unus. Mikrobiologi Air dan Dasar-dasar Pengolahan Buangan secara Biologis. Bandung: PT. Alumni, 2008.

VK, Dehswal, dkkences. “Isolation and Characterization of Pseudomonas Strain from Potatoes Rhizophere at Dehradun Valley, India” International Journal of Basic and Aplied Scieces 2 No. 2 (2013), http://Repository. Usu. Ac. Id/ Bitstream/ 1234 56789/15815/1/Skm-Agu2005 %20 %28 9% 29. Pdf  (10 Juni 2015): 53-58.

Wahyuningtyas, Puspita. “Studi Pembuatan Enzim Selulase Dari Mikrofungi Trichoderma reesei Dengan Substrat Jerami Padi Sebagai Katalis Hidrolisis Enzimatik Pada Produksi Bioetanol” Jurnal Bioproses Komoditas Tropis 1 No. 1 (2013), http:// www. google. com/url?sa= t&rct=j&q= &esrc=s&source= web&cd=3&cad=rja&uact=8&ved.pdf (14 Juni 2015), h. 21-25.

Yanti, Hamdiyati. “Pembuatan Media Agar Dan Sterilisasi” Jurnal Pendidikan Biologi (2011), http://File. Upi. Edu/ Direktori/ FPMIPA/ 196611031991012-Yanti_Hamdiyati/ Pembuatan_Media%26  pembiakan_ Mikroba. Pdf (14 Juni 2015), h. 1-4.